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单B细胞抗体技术的关键步骤


单个B细胞抗体技术作为新一代抗体开发技术,可以从单个B细胞中高效、快速的分离抗体,是继杂交瘤、噬菌体展

示后又一抗体产生技术的突破。它是根据每一个B细胞只含有一个功能性重链可变区DNA序列和一个轻链可变区DNA序

列,以及每一个B细胞只产生一种特异性抗体的特性,从免疫动物组织或外周血中分离抗原特异性B细胞,通过单细胞

PCR技术从单个抗体分泌B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因,然后在哺乳动物细胞内表达获得具有生物活性的单克

隆抗体。

这种技术的特点,是“从打过胜仗的老兵身上找武器”。一是省去了先用抗原免疫小鼠这一步,二是不再依赖必须与骨

髓瘤杂交的小鼠B细胞。有了这一段基因,无论插到什么细胞都可以培养并量产,其效果类似大肠杆菌生产基因重组人胰

岛素。

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                                                                                       典型的单个B细胞技术流程


它的主要流程为先从免疫动物或人的身上获取外周血单个核细胞,再进行抗原特异性结合B细胞的分选,接着通过

PCR扩增技术得到单个B细胞抗体可变区基因,再通过载体构建获得抗体表达,最后进行产物验证。在此过程中,单个B

细胞的分离是单B细胞技术最关键的步骤。目前有多种基于单细胞分离的技术,如磁珠分选法、微雕刻和ISAAC方法,流

式分选法及微流控分选法等。


流式分选法是目前单B细胞技术应用较广泛的一种,它是基于抗原抗体的特异性反应,利用荧光素标记的B细胞表面

分子的抗体以及标记的特异性抗原,通过多色流式分析与分选,筛选抗原特异性B细胞。流式分选可以直接将单个抗原特

异性B细胞分选入细胞培养板的单孔中,进行后续的抗体基因扩增与测定。该技术优点:分离B细胞快速、准确、大量、

多参数同时分析。


丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特的CytoFLEX SRT分选型流式细胞仪是新一代的高效细胞分选平台,适用于多色免

疫分型,可进行稳定高表达细胞系的开发、单细胞测序应用等。CytoFLEX SRT流式细胞分选仪提供七种不同检测器配

置,多达 15 种荧光颜色用于区分细胞群,能够区分细胞间的细微差异,多色应用超高灵敏度提高筛选精度;拥有4 路分

选模式、混合分选模式、复杂分选逻辑等分选方式,能够捕捉其他分选液流中丢弃的细胞,并保存宝贵细胞。


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                                                                               贝克曼库尔特CytoFLEX SRT流式细胞分选仪


CytoFLEX SRT流式细胞分选仪使用垂直分选模式(Straight Down Mode),利用无电垂直向下的液流,而不是加载

电荷的偏转液流。在进行单细胞索引分选时,使用这种模式可以在精确分选单细胞的同时获得更好地分选后活率。

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                                                                    EL4小鼠T细胞淋巴瘤细胞的培养后活率


CytoFLEX SRT配套的数据获取和分析软件界面直观,方便多色分析;采用创新的设置、监测和液流维持系统,实现

工作流自动化,节省研发者大量时间和精力。

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                                                                                       CytEXPERT SRT软件界面


此外,美谷分子仪器的CloneSelect 高通量单细胞分离系统,基于微流控分离技术,使用专有的喷墨式一次性单向分

离槽,可以轻柔而高效地分离单个细胞。该系统拥有高分辨率的明场和荧光成像,可以对细胞进行分选图像采集,获得

单克隆的图像证据,具有潜在的单个B细胞分离的应用价值。

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                                                                       CloneSelect 高通量单细胞分离系统

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                                                                                           单细胞分选过程图像记录


通过单细胞分离技术获得的单个特异性B细胞,经过单细胞PCR技术从B细胞中扩增IgG重链和轻链可变区基因,并

通过测序获得序列信息,再通过基因工程技术,进行载体构建、抗体表达和验证。


单个B细胞抗体技术制备的单克隆抗体,保留了丰富的基因多样性及轻重链可变区天然配对,并且制备效率高,目前

已经广泛应用于抗病毒治疗、神经性疾病治疗、免疫疾病治疗等抗体药物的开发。



文章来源:美谷分子仪器公众号

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