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酶标仪上的 Western Blot 检测

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                                                                                  配图来自百度


Western Blot(蛋白质印迹法)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,也是进行蛋白质

分析最流行和成熟的技术之一。1979 年瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的

 HarryTowbin 首次提出该方法。

Western Blot(蛋白质印迹法)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,也是进行蛋白质分析

最流行和成熟的技术之一。1979 年瑞士米歇尔弗雷德里希生物研究所(Friedrich Miescher Institute)的

 HarryTowbin 首次提出该方法。


酶标仪作为常规检测仪器,经过多年的发展,已经可以基于时间分辨荧光(Time Resolved Fluorescence,TRF)技

术进行 Western Blot (以下简称 WB)的检测,接下来,Spectra 博士将带您了解 WB 在酶标仪上的检测原理及操

作步骤。

常规 WB 检测基本原理及步骤

原  理

经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体( NC 膜、PVDF 膜)上,固相载体以非共价键形式吸

附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的

抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目

的基因表达的蛋白成分。

步  骤

1. 蛋白样本提取制备

2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品

3. 转膜

4. 封闭及孵育

5. 显色

Western Blot 显色的方法主要有放射自显影、底物化学发光 ECL、底物荧光 ECF 及底物 DAB 呈色四种。其中化学

发光法二抗常用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记,反应底物为过氧化物+鲁米诺,如遇到

 HRP,即发光。

酶标仪上基于 TRF 的 WB 检测

在 Molecular Devices 部分型号的酶标仪上,可采用 ScanLater Western Blot 检测系统实现 WB 的检测。ScanLater

 检测是基于时间分辨荧光(TRF)原理的 WB 检测。TRF 是目前已知降低散射光和自发荧光背景和实现高于普通荧光

检测灵敏度的最佳荧光检测方法之一。ScanLater Western Blot 试剂盒,包括铕标记二抗,无需其他优化直接可用于结

合已知常用一抗。不需要底物的 TRF Western Blot 检测方法,结合了化学发光和一般荧光检测的优势,极大地提高

了信号的稳定性和检测时间的灵活性。

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                                                               ScanLater 蛋白检测示意图


操作步骤

01

选择膜扫描的区域。

打开 SoftMax Pro 软件,选择 ScanLater WB 卡盒(仪器型号 SpectraMax i3x 或者 SpectraMax Paradigm)或者

 TRF 模式下的 Membrane(仪器型号 SpectraMax iD5 )。

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                                                                                    卡盒式酶标仪软件界面

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                                                                             SpectraMax iD5软件界面

02

选择膜扫描的区域。

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03

选择膜扫描的区域。将带有膜的适配器放入托板架上。

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04

选择膜扫描的区域。点击 Read ,保存文档,进行初次扫描,扫描结果可根据需要赋予不同的颜色。

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05

圈选 ROI ,进行高分辨率扫描。

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06

选择膜扫描的区域。进行条带定性与定量分析。

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07

保存结果。

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应用举例

使用 Scanlater Western Blot 技术检测痕量表达的内源性泛素化 Rad-18 蛋白(参与 UV -损伤 DNA 修复过程):使

用不同浓度(0,50,100 ppm)的致癌物 MMS(一种烷化剂)处理 HEK293 细胞,然后分别使用 Scanlater WB

 法和化学发光法进行检测和结果对比(Stanford University):

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总结:WB 膜被置于酶标仪内,然后使用 TRF 卡盒进行 WB 膜优化扫描。此方法具有以下优势:

1.信号稳定:该方法不涉及酶的检测,加之铕元素-螯合物标记物具有很强的光漂白抗性,因而信号十分稳定,能至几周

到几个月,这就允许对膜进行重复扫描,以及可能进行不同条带的强度对比和根据标品进行更精确的定量。

2.背景消除:铕元素时间分辨荧光标记,具有超长荧光寿命,使用 TRF 检测模式能够极大地降低自发荧光和其他来源的

背景噪声。

3.节省时间和成本:无需进行 ECL 般的耗时优化过程;不再需要成本高昂的 X-射线胶片和显影剂。

4.即插即用:可随时在 SpectraMax i3x、SpectraMax Paradigm  或 SpectraMaxiD5 多功能酶标仪上进行高性能 WB 检

测,极大地扩展了其在实验室研究方面的应用。



文章来源:美谷分子仪器公众号

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